РЕЗУЛТАТИ, ПОЛУЧЕНИ ПРИ ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПРОЕКТА


  • In situ изследвания


    • През 2015 г. е направена оценка на състоянието на целевите видове, допълнена през 2017 г. Популациите са локализирани с GPS устройства. За мониторинга и определяне състоянието на популациите на видовете, включени в Националната система за мониторинг на биологичното разнообразие , са използвани Методика за мониторинг на висши растения и Методика за оценка на състоянието на висши растения от НСМБР на ИАОС . Определени са основните заплахи за конкретните популации на целевите видове.

    Събран е растителен материал за фундаменталните научни изследвания, при спазване на нормативните изисквания за опазване растителното богатство на България (съгласувано с МОСВ във връзка със Закона за биологичното разнообразие, чл. 35, т.5)

    Организирани са няколко акции по връщане на in vitro размножени и аклиматизирани в опитното поле на ИБЕИ растения от 5 вида (при планирани 3): Centaurea davidovii, C. pseudaxillaris, Verbascum tzar-borisii (март-юни 2015), V. davidoffii, V. anisophyllum (юни 2017), в естествените им популации с цел подсилването им. В тази дейност взеха участие и доброволци. Направен е мониторинг и на засадените в популациите растения и е отчетена преживяемостта им. Същевременно е проведена и кампания по популяризирането на дейностите по проекта сред местните общности, с цел повишаване на екологичното съзнание на местното население. Раздадени са подготвените за целта брошура, книгоразделители и календарчета, рекламиращи опазването на растителното разнообразие в България, конкретно на три от целевите видове растения, под надслов “Спаси ендемит!”.

    Снимка Описание
    Засаждане на in vitro и in vivo получени растения от Verbascum tzar-borisii в популацията му Пробит камък, община Провадия
    Засаждане на in vitro размножени растения от Centaurea pseudaxillaris , в популацията на вида край с. Добрич, община Димитровград.
    Засаждане на in vitro размножени растения от Centaurea davidovii в популацията й край х. Козята стена, Централен Балкан.
    Засаждане на in vitro размножени растения от Verbascum anisophyllum в популацията му под вр. Виден, Конявска планина.
    Среща на участници от научния екип по проекта с местните природозащитни власти..




  • Охарактеризиране на генетичното разнообразие на целевите видове


    • Охарактеризиране на генетичното разнообразие на целевите видове Проучването на генетичното разнообразие на естествените популации чрез молекулярни анализи (ДНК-маркерни системи) допринася за оптимално съхранение и устойчиво ползване на наличните генетични ресурси. Резултатите от проведените при всички целеви видове ISSR-PCR експерименти са обработени с подходящи софтуерни програми. Изследвана е и генетичната идентичност на клон-популацията, получена от едно семе чрез вегетативно in vitro размножаване на C. davidovii.

    Създадени са ДНК-колекции за анализ на целевите видове. Проведени са молекулярни анализи и е направена софтуерна обработка на резултатите (GelAnalyser, GenAlEx, AFLP-SURV, STRUCTURE, MEGA, Past и др.). Получените резултати ясно демонстрират високо генетично разнообразие при популациите на целевите видове от род Verbascum и род Centaurea, което е индикация, че видове с ефективна система за размножаване се характеризират с високи нива на генетично разнообразие, независимо от ниската си численост и ограничен брой естествени популации.

    В същото време, високият брой уникални алели и високата степен на генетична дифeренциация между популациите на целевите видове от род Verbascum и род Centaurea е доказателство, че генетичният поток не е в състояние да компенсира загубата на алели в резултат на случайни процеси, дължащи се на генетичен дрейф.

    ISSR профил на растения от Verbascum tzar-borisii: популации Пробития камък (1-14) и Сиври тепе (15.18), амплифицирани с праймер (GA)8T, M: 100 bp Plus DNA Ladder


    Анализът на няколко популации на Glaucium flavum по Българското Черноморско крайбрежие показа сравнително ниско генетично разнообразие, което е знак за силно ограничени способности за адаптация към променящите се условия на околната среда, като резултат от антропогенна депресия. Този генетичен модел вероятно се дължи на ниската численост и малкия размер на част от популациите и на неефективния начин на размножаване.

    Поставено е началото на филогенетичния модел за реконструкция на еволюцията на таксоните от два от най-богатите на ендемити родове в България: Centaurea и Verbascum.

    Резултатите осигуряват ценна информация на генетично ниво, която ще послужи за изготвяне на нови ефективни стратегии за бъдещо опазване и устойчиво ползване на наличните генетични ресурси на изследваните видове.



  • In vitro култивиране


    • Изследвана е кълняемостта на семената от целевите видове при условия in vitro и е повишена чрез стимулиране с гиберелинова киселина и др. Създадени са подходящи протоколи за in vitro размножаване на 6 от седемте вида. Изследвано е влиянието на различни растежни регулатори в средата върху регенерацията, както и морфологичните различия при растения, получени чрез директна и индиректна органогенеза.

    На база на сравнителен анализ са подбрани най-подходящите хранителни среди за размножаване на всеки целеви вид. Единствено при C. achtarovii не бяха получени растения поради проблеми с кълняемостта на семената.

    Снимка Описание
    In vitro покълване на семена от Verbascum davidoffii
    Соматична ембриогенеза при Glaucium flavum.
    In vitro клонално размножаване на Centaurea davidovii и цъфтеж при подходяща хранителна среда.
    In vitro растения от Verbascum tzar-borisii, получени чрез директна и индиректна органогенеза: ясно се виждат морфологичните различия на регенерантите.


    In vitro растенията са успешно аклиматизирани към природни условия, след предварителна двустепенна адаптация към нестерилни условия:

    1) Пренасяне в саксийки с подходяща почвена смес, в климатичен шкаф при стриктен контрол на температурния и светлинния режим и постепенно намаляване на относителната влажност на въздуха;

    2) Във фитотронно помещение с по-големи амплитуди на параметрите на околната среда.

    Снимка Описание
    Ex vitro адаптация на растения от Centaurea davidovii в климатична камера
    Адаптиране на растения от Glaucium flavum във фитотрон.


    За опазване на видовете са създадени ex situ колекции в ИБЕИ-БАН (от C. davidovii, C. pseudaxillaris, V. tzar-borisii и V.anisophyllum). Растения от C. davidovii, V.tzar-borisii, V. anisophyllum, V.davidoffii, са подарени на Ботаническите градини на БАН (Витоша) и на СУ „Св. Кл. Охридски“ (Варна). Между 6 и 45 индивида от различните видове са засадени в изходните популации, с цел in situ опазването им.

    Снимка Описание
    Адаптиране и цъфтеж на Verbascum tzar-borisii в оранжерията на ИБЕИ-БАН.
    Цъфтящи растения от Centaurea pseudoxillaris в еx situ колекцията на ИБЕИ-БАН.
    Цъфтящи растения от Verbascum anisophyllum , в еx situ колекцията на ИБЕИ-БАН.
    Растения от Verbascum tzar-borisii и Centaurea davidovii в Ботаническата градина на СУ „Св. Кл. Охридски“ във Варна.



  • Ембриологични и хистологични проучвания


    • Установени са особеностите на размножителните системи, на процесите и структурите в генеративната сфера, които са от особено важно значение за разкриване на характера и размера на растителните популации на видове с консервационно значение.

    Определени са поленовата и семенната продукция и жизненост, въз основа на които е определен репродуктивния потенциал на целевите видове. Получените резултати от ембриологичните проучвания са важни за изграждане на адекватни стратегии за опазването на видовете.

    Снимка Описание
    Оценка на жизнеността на полен от Glaucium flavum (червените поленови зърна са жизнени, а безцветните – нежизнени).
    Жизненост на семената – оценка на жизнеността на зародишите при Glaucium flavum чрез тетразоловия тест.
    Хистологично изследване: развитие на женския гаметофит при Centaurea achtarovii .



  • Физиологично състояние на растения от естествените популации, in vitro отгледани и ex vitro аклиматизирани растения


    • Направен е анализ на антиоксидантния капацитет на растения от естествените популации на Verbascum tzar-borisii и Verbascum anisophyllum, който включва обща антиоксидантна активност, капацитет за улавяне на свободни радикали, съдържание на флавоноиди и антоциани. При сравнителния анализ се установява, че двете популации на V. tzar-borisii, локализирани в Сиври тепе и Пробит камък, показват по-висока антиоксиданта активност в сравнение с популациите на V. anisophyllum, локализирани във Вуково и Цървеняно.

    Най-висок антиоксидантен потенциал е установен при популацията на V. tzar-borisii от Сиври тепе. По-високата активност на антиосидантната защитна система отразява повишена продукция на активни кислородни форми в резултат от действието на стресови фактори на околната среда в естествените местообитания на изследваните популации.

    Изясняването на факторите, които повлияват физиологичното състояние по време на in vitro размножаването е важно за оптимизиране на протоколите за микроразмножаване, както и последващата ефективна ex vitro аклиматизаця на растенията от целевите видове. Тествано е влиянието на растежни регулатори от ауксинов и цитокининов тип и на други компоненти на хранителната среда, върху физиологичното състояние на размножавани in vitro растения, както и на ex vitro аклиматизирани растения от родовете Verbascum и Glaucium.

    Физиологичната характеристика е направена въз основа на промените в основните класове фитохормони и растежни регулатори, капацитета на антиоксидантната защитна система, която включва ензимни и неензимни компоненти, и функционалното състояние на фотосинтетичния апарат на изследваните растения. На базата на направената физиологична характеристика са подбрани най-подходящите среди за ефективно микроразмножаване, както и за оптимизиране на процеса на ex vitro адаптиране в естествени условия на тези ценни за българската флора застрашени растителни видове.

    Снимка Описание
    Измерване на фотосинтетичната активност на in vitro растения и на ex vitro адаптирани растения в климатичен шкаф и във фитотрон


    Данните за фотосинтетичната активност, промените в хормоналния статус и антиоксидантния капацитет на прорастъци от Verbascum tzar-borissii, култивирани в условия in vitro, дават основание да се направи заключение, че видът на добавените растежни регулатори в хранителната среда е от съществено значение за функционалното състояние на фотосинтетичния апарат, както и за съдържанието на биологично активни цитокинини, нивото на абсцизинова киселина и на нискомолекулни антиоксиданти.

    В зависимост от тези показатели могат да се селектират най-подходящите цитокинини и ауксини, както и техните концентрации в хранителните среди.

    Снимка Описание
    Субкултивиране на Verbascum tzar-borisii на среди с различни растежни регулатори: виждат се ясно морфологичните различия в получените in vitro растения, както и образуването на калус в някои среди



  • Метаболитно профилиране


    • Метаболитните профили на метаноловите екстракти от листни проби от 5 български популации на Glaucium flavum са анализирани чрез GC/MS. Идентифицирани са съединения, принадлежащи към основни групи вещества: алкалоиди, мастни и фенолни киселини, мастни алкохоли, въглехидрати, алкани и други. Основният алкалоид в алкалоидната фракция е глауцин, с изключение на пробата от Шкорпиловци, където изокоридинът е доминиращ.

    При алкалоидния профил на пробата от Синеморец алкалоида салутаридин е идентифициран в сравнително високо количество. Октадекан (алкан), хексадеканол (мастен алкохол), мастните киселини: хексадеканова киселина (С16:0) и октадекаприенова киселина (С18:3) са преобладаващите компоненти на липидната фракция.

    В полярната фракция основните хроматографски пикове са идентифицирани като захароза, фруктоза и мио-инозитол. Фуруловата и р-хидроксиканелената киселини са идентифицирани като основни компоненти на фенолната фракция. Въз основа на алкалоидния състав на листата на изследваните популации са наблюдавани три типа профили. Не са установени значителни разлики по отношение на другите метаболити.
    Хроматограми на алкалоидния профил на проби от Поморие (A), Шкорпиловци (B) и Синеморец (C)
    Хроматограма на липидна фракция от листна проба на Glaucium flavum
    Хроматограма на полярна фракция от листна проба на Glaucium flavum
    Хроматограма на фенолна фракция от листна проба на Glaucium flavum


    В целевите видове от р. Verbascum e изследвано съдържанието на фенолни киселини чрез GC/MS. Определени са профилите на метанолно екстрахиращите се свободни и свързани фенолни киселини и на метанолно неекстрахиращите се, свързани фенолни киселини.

    Идентифицирани са 16 фенолни киселини и техни производни. Феруловата киселина е определена като доминираща индивидуална киселина присъстваща във всички проби. Хидроканелената, ваниловата и р-хидроксибензоената киселина са също главни киселини. Наличието на сирингова, генистинова, изоферулова, дихидроферулова, еудезманова е докладвано за първи път за род Verbascum.

    Най-голямо разнообразие от фенолни киселини е установено във фракциите, съдържащи метонононеразтворими, свързани фенолни киселини. Профилите на фенолни киселини в двата изследвани вида са сходни, макар че в тези от V. davidoffii са идентифицирани още няколко съединения, но в минорни количества.
    Хроматограма на фракция от V. davidoffii, съдържаща метанолно неразтворими свързани фенолни киселини, киселинно хидролизирани и тяхното идентифициране чрез АМDIS



  • Популяризиране на резултатите, мобилност на учените и обмяна на опит


    • В рамките на проекта бяха разработени една докторска дисертация и една магистърска дипломна работа, съответно при изследване на видовете Glaucium flavum и Centaurea achtarovii.

    В допълнение, в задачите по in vitro размножаване на целевите видове и ex vitro адаптацията им, бяха включени студенти, обучаващи се в ИБЕИ по проекта на МОН „Студентски практики“, което им даде възможност да получат реална представа за работата на изследователите в БАН.


    Главна страница